منابع خطا در تست های الایزا

1- باز کردن فویل حاوی پلیت (بلافاصله بعد از آنکه از یخچال خارج شد): پلیت سرد بخار آب موجود در هوا را به قطرات کوچکی تبدیل می کند که روی جدارهای چاهکها خواهد نشست. این عمل سبب می شود که در برخی تست ها که حجم نمونه کم است (مثلأ 10 میکرولیتر) سبب رقیق شدن نمونه شود.

2- عدم رعایت روش ذکر شده در بروشور (کمپانی سازنده می تواند بدون اطلاع قبلی روش کار خود را عوض کند).

3- در هنگام باز کردن فویل حاوی پلیت به کپسول نم گیر موجود در آن دقت شود. اگر پوشش فوق سوراخ باشد کپسول نم گیر می تواند یا تغییر رنگ دهد و یا سیلیکاژل موجود در آن به هم بچسبد.

4- دقت شود که در تست مورد نظر همولیز تأثیر می گذارد؟

هموگلوبین به دلیل ماهیت پروتئینی، فعالیت پراکسیدازی داشته و همچنین به دلیل وجود آهن و هم می تواند سرعت واکنش پراکسید هیدروژن و کروموژن را تسریع و بطور کاذب باعث افزایش جذب نوری شود. از طرفی هموگلوبین واکنش آنتی ژن و آنتی بادی را دستخوش تغییر می کند و زمان به تعادل رسیدن واکنش را افزایش می دهد (مثل Free T4 که به طور کاذب کاهش می یابد).

5- آیا مجاز به استفاده از پلاسما می باشیم و در صورت استفاده از پلاسما آیا ضد انقعاد خاصی مورد نیاز است؟

در این موارد باید به بروشور کیت مراجعه شود و با دقت بررسی شود تا نوع نمونه توصیه شده بررسی شود. چه نوع پلاسما و ضدانعقاد می توان برای بدست آوردن پلاسما استفاده کرد. پلاسمایی که از سیترات سدیم تهیه شده به دلیل رقیق شدن پلاسما مناسب نمی باشد.

ضد انعقاد EDTA به عنوان یک شلاته کننده یونهای فلزی می تواند روی (Zn) که به عنوان کوفاکتور آنزیم آلکالین فسفاتاز را مهار می کند.

فلوئور سدیم که به عنوان نگهدارنده قند استفاده می شود می تواند فعالیت آنزیم اوره آز را مهار می کند بنابراین در سنجش هایی که از آنزیم اوره آز به عنوان ماده نشانگر استفاده شده است تداخل می کند.

سدیم آزاید به عنوان به عنوان یک مهار کننده قوی آنزیم پراکسیداز است و هرگز نباید در سنجش هیی که نشانگر آنزیمی آنها پراکسیداز است از نمونه حاوی سدیم آزاید استفاده شود.

6- پلیت ها در هنگام رنگزایی باید در دمای 25- 18 درجه سانتی گراد قرار گرفته و در معرض باد سرد و گرم نباشند چرا که دمای محیط می تواند سرعت واکنش رنگزایی را تغییر داده و در نتیجه منجر به رنگزایی کم یا زیاد شده و با بی اعتبار کردن کنترل مثبت و منفی کل کار انجام شده را بی اعتبار (Invalid) می کنند.

7- خطای در زمان انکوباسیون (خطای زمانی در انکوباسیون های کوتاه مدت بیشتر می باشد). در مرحله انکوباسیون TMB (Tetramethylbenzidine) - که همان سوبسترا بوده و در اثر آنزیم به یک محصول رنگی تبدیل می شود- به هیچ وجه از فویل آلومینیومی برای پوشاندن سطح پلیت استفاده نشود.

8- رعایت زمان خیس خوردن (Soak Time) سبب می شود که اتصالات غیر اختصاصی از چاهکها کنده شود. عدم رعایت این موضوع موجب ایجاد یک رنگ زمینه در کل چاهکهای پلیت کاری خواهد شد و اگر تست فاقد چاهک بلانک باشد این موضوع منجر به ایجاد جوابهای کاذبی می شود. این زمان در کیت آمده است و بین 30 ثانیه تا چند دقیقه متغیر است.

9- بعد از خواندن OD پلیت ها اگر OD چاهکی بالا باشد بهتر است به رنگ چاهک دقت شود و اگر رنگ چاهک پررنگ نباشد ممکن است ناشی از چسبیدن یک ماده کدر مثل پودر دستکش جراحی در پشت پلیت باشد که در نتیجه باید با یک پارچه بدون پرز پشت پلیت پاک شود.

10- در بین مراحل سنجش نباید وقفه بیافتد چرا که ممکن است منجر به تبخیر محتویات چاهک ها شود.

11- مشکلات مرتبط به شستشو: عمل شستشو جهت جدا کردن ترکیبات اتصال یافته به کف چاهک از ترکیباتی که متصل نشده اند صورت می گیرد. غیر از ترکیبات محلول شستشو نکات دیگری نیز باید مدنظر قرار گیرد. مشکلات مربوط به شستشو به سختی قابل تشخیص بوده و به صورت اتفاقی با خوانده هایی که خیلی بالا و یا پایین باشد مشخص می شوند. رفع این مشکل کالیبره کردن مجدد دستگاه شوینده است. محلول شستشو معمولأ غلیظ تر بوده و باید در آزمایشگاه رقیق شود. اگر رقت درست صورت نگیرد و محلول غلیظ تر از حد توصیه شده باشد منجر به تخریب و جدا شدن مولولکولهای اتصال یافته می شود و بر عکس کاهش توانایی محلول شستشو بدلیل رقیق سازی زیاد باعث عدم جدا شدن اتصالات غیر اختصاصی و ایجاد جذب زمینه ای بالا می شود. مرحله شستشو حداقل باید سه بار انجام شود و محلول اضافی باید تخلیه شده و یا آسپیره گردد. در نهایت باید محلول اضافه داخل چاهک با کوبیدن بر سطح یک کاغذ یا دستمال نم گیر خالی شود. اگر محلول شستشو واجد حباب باشد از وارد شدن آن به داخل چاهک ها جلوگیری شود چرا که این حباب سطح تماس محلول واش را با چاهک کم کرده و اثرات شستشو را کاهش می دهد. pH آب مقطری که برای محلول شستشو استفاده می شود اگر بیش از حد اسیدی و یا قلیایی باشد می تواند برروی اتصالات آنتی ژن – آنتی بادی اثر گذاشته و روی سنجش تاثیر بگذارد.

12- در مورد شستشوی اتوماتیک با دستگاه واشر دقت شود که سرعت ریختن محلول و آسپیراسیون محلول تنظیم باشد.

13- لیپمی در سنجش آنالیت هایی که یک مولکول آب گریز است بدلیل آنکه توزیع آنالیت بین دو فاز آب گریز و آب دوست به دلیل وجود لیپید مختل می شود. و همینطور در بعضی از آنالیت ها که به پروتئین حامل متصل می شود وجود اسید چرب آزاد ممکن است در اتصال آنالیت به پروتئین حامل تداخل نماید و سبب افزایش کاذب میزان آنالیت آزاد می شود. (به خصوص هورومونهای تیروئیدی و استروئیدی). بنابراین ناشتا بودن در این ازمایشات ضروری است.

14- ذوب و فریز کردن مجدد سرم در بعضی از آنالیتها تأثیر می گذارد (در پروژسترون و تستوسترون بی تاثیر می باشد).

15- بهتر است برای تخلیه حجم برداشتی پیستون سمپلر را فقط تا مکث اول به پائین فشار دهید. در صورتی که پیستون تا مکث دوم پائین آورده شود ایجاد حباب می نماید که در سیستم سنجش تداخل کند. معرفها و نمونه ها نباید از بالا به داخل چاهک چکانده شود. نوک سمپلر نباید با ته چاهک تماس یابد. نباید با زاویه شدید به دیواره چاهک تماس داده شود.